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粒子分析技術-粒子計數

2022年09月電子報

　　粒子計數在從環境到生物應用的各個領域都很重要並被廣泛使用，例如：計數灰塵顆粒潔淨室設施需要；潤滑系統研究需要計算碎片顆粒；計數污染物顆粒是水淨化系統的關鍵因素;和計數白血球數量對於許多生物醫學診斷目的是必不可少的，例如檢測 HIV 感染狀況。粒子計數技術已得到進一步發展，可檢測單個 DNA 分子和分析 DNA 含量。然而，傳統的粒子計數方法依賴於昂貴、笨重和復雜的儀器，並且需要大量的樣品和試劑。這些是許多粒子計數應用的障礙。

　　微流體裝置在過去十年中得到了特別的研究，並顯示出在便攜式和低成本應用方面的巨大潛力，特別是在醫療診斷方面。光刻製造技術使製造與電極和傳感器以及微流體控制技術（例如電動力學）集成的廉價和小型設備成為可能，能夠控制微通道和奈米通道中的顆粒和液體流動。此外，微流體裝置特別適用於可獲得或需要極少量樣品的應用。基於微流體的粒子計數方法與傳統方法相比具有很大的優勢，並且允許開發準確、廉價和便攜式的粒子計數設備。

　　微流控粒子計數器是流式細胞儀分析等生物醫學診斷應用中的重要工具。文中綜述了微流控裝置中粒子計數的主要方法。通過改進信號放大和降噪技術，微流控電阻脈衝傳感器的靈敏度比傳統的庫爾特計數器有所提高。基於奈米孔傳感器的方法用於單個 DNA分子分析，而電容計數器可用於低電導率液體和感測細胞內容物的變化。光散射和光阻擋計數器更適合檢測較大的顆粒或濃縮顆粒。使用螢光檢測的方法能夠區分大小相似但類型不同但用不同螢光染料標記的顆粒。微粒圖像測速方法也已用於檢測和分析流場中的粒子。微流控粒子計數器的一般限制是低通量，未來需要改進。許多實際的應用需要集合兩種或多種現有的微流體粒子計數技術。

參考文獻：Microfluidics and Nanofluidics volume 7, Article number: 739 (2009)

微流體粒子計數的主要分析技術

◉分析方法簡介：庫爾特計數器

　　庫爾特計數器也許是最流行的常規粒子計數方法。其測量原理是利用電阻脈衝法，適用於一些微流體粒子計數。Coulter Counter 最早由 Wallace H. Coulter 在二戰期間發明並獲得專利（Coulter 1953）。當庫爾特為美國海軍工作時，他使用這種技術來計算浮游生物粒子的數量，這些粒子總是在聲納上引起大的迴聲​​。在庫爾特計數器中，壁上的小孔浸入容器中，容器中的顆粒懸浮在低濃度電解質溶液中。放置兩個電極：一個在孔的前面，一個在孔的後面，當施加電場時，電流路徑由電解質提供（圖)。當顆粒通過孔時，相當於顆粒浸入一定體積的電解質從傳感區移出。這會導致孔徑上的阻抗發生短期變化。這種變化可以以電壓脈衝或電流脈衝來測量。脈衝高度與感測粒子的體積成正比。如果假設粒子密度恆定，則脈衝高度也與粒子質量成正比。因此，該技術也稱為孔徑技術。

　　由於庫爾特計數器簡單、靈敏、可靠，因此被廣泛應用於包括血球計數和分析、蛋白質、病毒等醫療領域。使用 Coulter 計數器，可以在很短的時間內完成大量血液樣本。如今，每台現代血液分析儀都在某種程度上採用了 Coulter 原理。雖然經過多年的發展，庫爾特計數器能準確可靠地檢測和分析顆粒，但它仍然存在許多缺點：體積大、重量重、複雜、功耗高、成本高、不便攜。

◉分析方法簡介：微流體電阻脈衝傳感器(RPS)

　　微流體電阻脈衝技術將 Coulter 計數器的基本工作原理應用於微通道，用於對微米和亞微米粒子進行計數。微流體RPS的主要優勢包括無標記顆粒檢測和簡單性，除了簡單的電路和微米或奈米級尺寸的通道外，無需其他外圍複雜儀器。因此，它主要適用於可攜式芯片實驗室，以檢測 DNA、蛋白質和血球等生物聚合物。然而，微流體RPS的流速較小，且微流體RPS的靈敏度受限於其孔徑大小，導致吞吐量和靈敏度較差。

　　為了提高靈敏度，Xu 等人和 Sridhar 等人使用16μm 的相對較寬的聚二甲基矽氧烷(PDMS)通道和金屬氧化物半導體場效應晶體管 (MOSFET)。他們通過監測MOSFET漏極電流調製而不是通過傳感通道的離子電流調製來檢測粒子。最近，Wu 等人開發了一種利用鏡像對稱通道結構和兩級差分放大器的微流體RPS方法（圖）。它們可以實現更好的信噪比。

◉分析方法簡介：奈米孔傳感器(NRS)

　　此處的奈米孔被稱為電絕緣膜中奈米尺寸的小孔，而奈米孔電阻傳感器 (NRS) 是奈米級庫爾特計數器，它使用奈米孔作為孔徑來檢測單個分子。NRS、Coulter 計數器和 RPS 的粒子檢測原理相同。根據奈米孔材料，有兩種類型的奈米孔：合成材料和天然材料。典型的天然奈米孔是脂質雙層中的生物蛋白質通道。

　　艾克森等人( 1999 ) 檢測到由外加電場驅動的α-溶血素通道中的單個 DNA 和 RNA 分子（圖）。由於小孔一次只能容納一條 DNA 或 RNA，因此在易位期間，多核苷酸內的核苷酸必須按順序和單列順序通過通道/孔。在這個過程中，不僅可以計數，還可以區分沿著 DNA 或 RNA 分子的嘧啶和嘌呤片段。這項研究的一個非常重要的應用是使用奈米孔對單個 DNA 和 RNA 分子進行直接測序。此外，奈米孔法也可用於測量小於 10 nm 通道中的小顆粒，如金屬離子、核酸和其他類型的聚合物。

　　生物奈米孔的幾何和化學性質可以通過基因工程重複控制。然而，生物奈米孔不是很堅固且尺寸不可調。即使在實驗室環境中，它也只能持續幾個小時。因此，人們努力製造人造的固態奈米孔來克服這一限制。基於合成材料的奈米孔通常由矽化合物膜製成，例如氮化矽。製造技術可以是聚焦離子束（FIB）雕刻或電子束雕刻。然而，仍然很難控制這些奈米通道的大小。幾乎不可能複製相同尺寸的合成奈米孔。此外，高製造成本是合成奈米孔顆粒傳感器進一步開發和應用需要克服的另一個障礙。

水平雙層裝置。一個U型管連接兩個浴槽，所有浴槽都裝有KCL緩衝液。浴槽過Ag-AgCl電極連接到Axopatch 200B放大器。管的一端有一個25微米孔徑的錐形尖端。穿過孔形成二植酰磷脂酰膽鹼/十六烷雙層,將一個或多個a-溶血素通道插入雙層以檢測單個DNA或RNA分子。

◉分析方法簡介：微流控電容計數器

　　電容計數器使用與庫爾特計數器類似的原理：當微米或亞微米粒子通過孔徑時，它測量的是交流電容而不是直流電阻。電容計數器對於檢測低電導液體中的顆粒特別有用，因為在導電性差的液體中難以測量由於顆粒通過而引起的電阻變化。過去，電容測量通常用於識別散裝材料和研究生物細胞的集合。然而，Sohn 等人採用這種技術來檢測和量化單個真核細胞核中 DNA的極化反應。他們構建了一個微流體裝置（圖），並使用注射泵將液體輸送到該裝置。在設備上使用頻率為1 kHz的電容橋來檢測電容變化以確定單個真核細胞的DNA含量。最近，Murali等人採用電容計數器實時監測潤滑油中的磨屑，避免機器發生災難性系統故障。與批量測量方法不同，它們可以掃描每個單獨的顆粒並確定顆粒的大小，而不受油品性質變化的影響。

　　與微流體RPS類似，電容法在樣品製備簡單、成本、尺寸和穩健性方面具有優勢。此外，電容法對探測各種有機和無機材料對外部電場的極化響應很敏感。然而，電容法由於電子測量中電極-導電液體界面處的電荷屏蔽效應而具有複雜性，且檢測電容需要交流電壓和頻率，因此需要調頻控制器，並且需要注射泵等外部支持來在通道中輸送液體。流量控制和頻率調製方面的這些限制是開發微流體電容粒子傳感器的障礙。

◉分析方法簡介：光散射和光阻擋計數器

　　光散射粒子計數器和阻光粒子計數器是基於光的粒子計數器的兩種相似類型。它們都使用雷射光光源（例如雷射光二極管）來照亮穿過雷射光束的單個粒子。這兩個計數器之間的區別在於如何測量光與粒子之間的相互作用以計數粒子。當光線照射到一個物體上時，它通常會分成三個部分。有些光會穿過物體，有些會被反射，其餘的會被物體吸收。這三種成分的比例是由粒子的材料組成的光學性質決定的。

　　光散射計數器使用粒子的反射光。如圖a所示，當源光照射到粒子上時，部分光被反射，反射光可以被位於與光路成一定角度的光點處的光檢測器檢測到。檢測到的光信號強度與顆粒大小相對應，檢測到的光信號脈衝數與顆粒數成正比。另一方面，擋光計數器（圖b) 測量粒子從檢測器吸收或反射的光。在這種佈置中，光直接聚焦到檢測器上；當粒子通過它們之間時，光電探測器會通過阻擋粒子感應到光強度的突然變化。很明顯，粒子越大，它會阻擋的光越多。原則上，光散射計數器檢測光，而遮光計數器檢測黑暗。光散射法比光阻擋法更靈敏。然而，為了聚焦和檢測特定角度的散射光，光散射計數器系統通常包含更多的光學元件和複雜的電子電路，這使得光散射計數器比阻光計數器更昂貴。阻光計數器廣泛用於檢測水中的顆粒物（例如水處理應用），而光散射計數器主要用於檢測大氣顆粒物。這些光散射和光阻擋計數器的主要缺點是與Coulter計數器相比靈敏度較低，因為這些基於光的粒子計數器的靈敏度取決於粒子的表面積，而Coulter計數器的靈敏度取決於粒子的體積。

◉分析方法簡介：螢光計數器

　　螢光是一種光學現象，其中光子的分子吸收觸發具有更長和更低能量波長的光子。吸收和發射光子之間的能量差異最終表現為分子旋轉、振動或熱量。這種螢光特性已應用於粒子計數。Lin 和 Lee提出了一種在沒有芯片光纖的微型流式細胞儀中進行螢光檢測的方法。在該系統中，PDMS 微芯片與 150 微米厚的玻璃基板粘合。雷射光通過濾光片立方體和光纖以激發微通道內的粒子。激發的螢光也被同一根光纖檢測到，並在光電檢測器中轉化為電信號。將光纖嵌入芯片中增加了製造芯片的難度和成本。然而，檢測到的螢光信號不是恆定的，因為它們取決於光纖檢測器和粒子之間的距離（靠近檢測器的粒子會產生更強的信號）。此外，光纖與通道的精確對準仍然難以實現。

　　一般來說，螢光是最靈敏的粒子檢測方法之一。然而，使用這種方法，粒子必須具有螢光特性，非螢光粒子必須用適當的螢光團標記。因此，該技術被廣泛用於區分特定目標粒子和其他粒子，並且經常與其他粒子計數技術結合使用。

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